温馨提示

尊敬的客户以及各位合作伙伴:

    为了防止别有用心之人,仿冒我司名义行事。请各位在与我司洽谈、交流以及合作的过程中认准带有我司LOGO头像的官方QQ以及华腾制药官方网站:www.huatengsci.com,所有公司的最新信息请以华腾制药官方网站公布的信息为准,顺祝商祺!

×
您好! 欢迎访问华腾制药   销售热线:400-859-2883

快捷导航栏 >>化学产品 生物试剂 PEG衍生物 天然产物 大批量询价

行业资讯

Industry Advisory

PEG化技术在蛋白质类药物中的应用

来源:医药行业分析 日期:2017/3/14 17:32:52

  蛋白质——多肽类药物(其中包括胰岛素、促红细胞生成素、生长激素、集落细胞刺激因子、α与β干扰素、白介素等)用于人类疾病的治疗近几年得到飞速发展,现已成为医药产品中的重要组成部分。估计蛋白质等高分子产品年增长率将会达到35%[1]。


  尽管有许多产品即将上市,但它们却存在诸如半衰期短、免疫原性及溶解性低、被酶水解等弊端;而且它们必须每日注射,成本较高,故而限制了众多低收入者对生物工程药品(大多为蛋白质——多肽类药物)的购买力。


  因而,把小分子药物连接到高分子上以获得具有缓释或靶向性能的高分子药物的研究一直受到人们的关注.其中对蛋白类药物进行修饰越来越成为药物工作着的研究热点,蛋白质化学修饰后主要优点是:能延长蛋白质在体内的半衰期、降低免疫原性和抗原性。另外可以减弱蛋白酶的水解作用,增加蛋白分子的可溶性等。


  用于蛋白质修饰的大分子很多,常见的有如下类型:聚乙二醇(包括聚乙二醇PEG和单甲基聚乙二醇mPEG);多糖类,如葡聚糖、右旋糖酐、淀粉等;同源蛋白质及人工合成的多肽,如聚丙氨酸等。其中聚乙二醇由于其良好的生物相容性、反应简单、价格低廉等优点受到较多的重视。


  聚乙二醇(PEG)是最常用的一种修饰剂,无毒、无致畸性、无免疫原性、具有非常好的水溶性和生物相容性,且生物相容性已获FDA认可。


  PEG修饰的蛋白类(亦称蛋白的PEG化)包括PEG与蛋白质或多肽类药物的物理结合物和化学修饰物,可大大改善蛋白类药物的一些性质。当蛋白类药物经PEG修饰后,可以将其优良性质赋予修饰后的药物分子,改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性,在其修饰的药物周围产生空间屏障,减少药物的酶解,避免在肾脏代谢中很快消除,并使药物能被免疫系统细胞识别[3],可增加蛋白药物的治疗指数,扩大临床应用等。


  蛋白质类药物的PEG化一直是药学领域研究的热点之一。国内开展有关聚乙二醇研究的主要有中国药科大学、沈阳药科大学、天津大学、中国科学院上海生物化学研究所、中国科学院成都有机化学研究所等,目前大多数还是局限于科研院所和学校,产业化水平较低,尚处于初始阶段[2]。


  经过30多年的研究探索,PEG修饰现已成功应用于蛋白类药物,国外多家公司研制的PEG-天冬酰胺酶、PEG-腺苷脱氨酶和PEG-α干扰素等近十个药物已经批准应用于临床。以下介绍PEG及其在蛋白质类药物改造方面的应用。


  1PEG化学结构和制备[3]


  聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)是用环氧乙烷与水或乙二醇逐步加成聚合得到的相对分子质量较低的水溶性聚醚,反应通式如下:


  环氧乙烷开环聚合是离子型聚合反应,用酸或碱作催化剂(常用碱或配位阳离子作催化剂),用水、乙二醇、乙醇或低相对分子质量聚乙二醇作引发剂,后者适合制备相对分子质量大于l000的聚合物。聚合方法可采用液相或气相聚合,用脂肪烃和芳烃作液相聚合溶剂,用氢氧化物作催化剂。此反应在l50~l80℃、0.3~0.4MPa下进行,反应器中使用稀有气体填充,以防环氧乙烷和空气形成爆炸性化合物。当反应达到预期相对分子质量时应降低压力,中和催化剂,用离子交换树脂除去无机物,冷却过滤即得成品。现在多用单甲氧基聚乙二醇(MPEG)作修饰剂,其结构式为


  2PEG的性质


  修饰蛋白质等高分子常用的PEG相对分子质量为200~20000,呈无色透明液体,大于l000在室温下呈白色或米色糊状或固体,微有异臭。PEG易溶于水和多数极性溶剂,不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂。PEG具有很强的吸湿性,随着相对分子质量的增大吸湿性迅速下降。它还具有微弱的表面活性,随着其水溶液浓度的增加,表面张力逐渐减小。相对分子质量较低的PEG水溶液黏度不高,随相对分子质量的增高而上升.


  PEG的大鼠口服半数致死量LD50分别为:PEG200为28.9ml/kg,PEG400为30.2ml/kg,PEG4000为59g/kg。PEG对皮肤刺激性很低,但高浓度时因其高吸水性对局部黏膜组织可能产生轻度刺激。PEG偶有致敏性,烧伤病人应用时有高渗性、代谢酸中毒及肾衰危险,因此凡有肾衰、大面积烧伤病和开口性外伤病人应慎用。产品中残留的乙二醇、二乙二醇和氧乙烯增加毒性和刺激性,乙二醇和二乙二醇总残留质量分数应<0.25%,氧乙烯残留质量分数应<0.02%。


  3PEG修饰蛋白类药物技术


  mPEGs修饰过程可以概括成以下步骤:


  环氧乙烷+甲氧离子→mPEGs→mPEGs的活化→活化的mPEGs+蛋白质化学反应→分离纯化→产物鉴定


  3.1PEG的活化


  PEG要和目标分子结合,需对PEG分子一端或两端进行活化,根据要连接分子的特性来选择活化所需的功能基团.对于蛋白质,首先要在-OH端活化,可以使用PEG活化试剂进行活化,常见的活化剂有氰尿酸氯化物等。mPEG常见的活化形式有:SS-PEG、SC-PEG、T-PEG等。


  活化方法主要分为非特异性活化方法和特异性活化方法。其中非特异性活化方法有溴化氰法,羰基二咪唑法,N-羟基琥珀酰亚胺法和氰脲酰氯法;特异性活化方法有PEG-醛水合法,半胱氨酸的聚乙二醇修饰,氧化羟基进行PEG修饰,氧化羟基进行PEG修饰,酶法定点连接聚乙二醇等。


  3.2PEG化蛋白质合成


  活化的mPEG理论上可以和蛋白质中主要的氨基酸:如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸等反应,反应可以在N端,也可以在C端.但以和赖氨酸、半胱氨酸及N端的基团反应最常见.在pH8~9.5室温下,反应30min左右,就可以合成精制的PEG化蛋白质。


  PEG反应过程中的一大问题是反应产物多样化.赖氨酸是在蛋白质分子中含量较高的氨基酸(含量可以大于10%),在各个位置上多个赖氨酸的存在,使反应可以表现为从PEG的零连接到多个连接,即使是只连上一个PEG分子的蛋白,也会表现为连接位置不同的多种多样的异构体.上述的反应在质量可控性、工艺重复性上均存在问题,因此人们研究了如何提高mPEG的纯度及如何使PEG与蛋白表面的特定位点结合,来减少反应副产物和异构体.在这方面,新一代的PEG技术已经有了很大的改进。


  3.3影响蛋白PEG化的因素


  除了上述的修饰技术的过程之外,PEG聚合物链本身的结构、长度、分子量等对聚乙二醇蛋白的特性也有很大的影响.此外修饰过程中反应的温度、pH值以及活性PEG与蛋白的比例均可能对聚乙二醇化的程度有影响,并产生不同的PEG与蛋白结合方式.例如一个蛋白分子结合一个PEG分子或蛋白的多个结合位点分别与PEG结合,进而影响到药物蛋白生物学活性的不同。


  PEG分子量的大小主要对PEG化的蛋白质的药代动力学产生影响。PEG分子越大,系统清除越慢,在体内循环时间延长。


  4PEG修饰后对蛋白质类药物的影响


  大多数蛋白质等高分子经PEG修饰后,其特性在一定程度上发生改变,许多不足之处得到改善。


  4.1免疫原性与抗原性消除或降低


  消除或降低蛋白质等高分子的抗原性效果明显[4]。如L-天门冬酰胺酶用PEG修饰后可消除抗原性。这是因为:人体免疫系统会自动识别异体蛋白质和其它异物,并将其歼灭掉。各种蛋白质一多肽类药物一旦经PEG处理后,可披上一层"伪装",从而避免被人体免疫系统视为异物而加以消灭。这样一来,PEG化的药物自然可大大延长体内作用时间。


  4.2热稳定性提高


  这是由于PEG共价连接蛋白质等高分子后,其天然构象产生一定的刚性,不易伸展失活,减少了分子内部基团的热振动,从而增加了热稳定性。热稳定性与PEG和蛋白质等高分子之问的交联点数目有关,单点交联并不明显,交联点增多稳定性提高。热稳定性提高的另外一个原因是PEG本身增加了蛋白质等高分子的表面亲水性,使其在水溶液中形成新的氢键和盐桥[5]。


  4.3体内半衰期延长


  许多蛋白质等高分子经PEG修饰后,抗蛋白水解酶、抗抑制剂等失活因子的能力和热稳定性提高,其体内半衰期比天然蛋白质等高分子长,对提高蛋白质等高分子的药用疗效极具意义.天门冬酰胺酶经PEG修饰后,体内半衰期可延长13倍。


  4.4溶解性增加


  药用PEG易溶于水和多数极性溶剂,不溶于脂肪烃类、苯和矿物油等非极性溶剂。随相对分子质量升高,其在极性溶剂中的溶解度逐渐下降。


  4.5对组织分布能力的改变


  一些蛋白质等高分子经PEG修饰后可改变组织的分布能力,能在血液中被靶器官选择性吸收。


  4.6毒性减少


  PEG可使大多数蛋白质等高分子毒性减少,且本身无毒性(相对分子质量>l000),相对分子质量为4000的PEG可按每千克体重l6g的剂量,以10%的溶液安全地注射人鼠、兔、猴等动物体内[6],不伤害蛋白质和细胞。如一些临床需求量极大且具有一定毒性的抗肿瘤药物(如喜树碱等)经聚乙二醇处理后,可大大降低毒性,并提高治疗效果。再如紫杉醇经聚乙二醇处理后,可延长其在体内的作用时间,从而提高晚期肺癌、卵巢癌和乳腺癌病人的存活率。


  4.7抗各类失活因子能力提高


  一些PEG修饰后的蛋白质等高分子抗蛋白水解酶水解、抗抑制剂、抗酸碱和有机溶剂等变性失活能力提高。原因是PEG所产生的空间屏蔽阻挡了失活因子的进攻。此外,蛋白质等高分子中对蛋白水解酶等失活因子敏感基团被修饰,使其能力提高。过氧化氢酶经PEG修饰后,抗胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶水解能力明显提高。


  4.8最适pH改变


  有些酶经PEG修饰后,最适pH值改变,这在生理和临床应用上以及工业生产中更好地发挥酶的催化作用方面极具意义。


  此外,还会改变酶学性质,动力学性质、等电点、电泳行为等,从而增强了对热、酸、碱和酶的耐受性而使稳定性显著提高。


  5应用


  5.1改变给药途径


  2005年,NOBEX公司关于利用PEG聚合物将目前需要注射的药物转化为口服制剂的技术被授予2项美国专利。该公司目前正利用此项技术和印度的一家生物技术公司Biocon合作开发口服胰岛素产品。NOBEX公司通过化学的方法将小的纯寡聚体偶联到多肽上一个或多个选择位点,从而得到一个新的适合于口服给药的分子实体。新分子实体的某些特征如稳定性、对酶的抗性以及药物的吸收得到了改善,在血液中的半衰期也得以延长。


  5.2PEG化干扰素


  这种新型干扰素制剂每周均只需注射1次,可用于治疗包括乙型肝炎在内的各种病毒性感染疾病。目前,PEG干扰素α联合利巴韦林已被证明是治疗CHC的最佳疗法。相比之下,普通干扰素注射液的药效仅能维持24小时。


  5.3PEG化水蛭素(hirudin)


  水蛭素是从水蛭唾液腺中分离得到的一类相对分子质量为7000的天然高分子药物。水蛭素用于抗血栓有较好的疗效。不同种属的大多数动物在静脉注射水蛭素时血浆半衰期都小于1h,用PEG修饰后其半衰期可大大增加。BASFAG公司用于外科手术的PEG-Hirudin已经进入Ⅱ期临床阶段[7]。


  5.4PEG化转移多聚β肽


  朱珺,王松梅等研究了抗肿瘤转移多聚β肽的聚乙二醇(PEG)化的方法及其作用。采用甲氧基聚


  乙二醇丙醛(mPEGALD5000)修饰多聚β肽;采用电泳和成像分析系统检测修饰率,以粘附实验检测生


  物活性。确定了最佳反应条件为:pH值为5,多聚β肽和mPEGALD5000的摩尔之比为1:10,反应温度为4oC,反应时间为24h。结果显示采用mPEGALD5000能有效地将多聚β肽PEG化;多聚β肽和PEG修饰物对肿瘤细胞与FN的粘附具有特异的抑制作用,且PEG修饰后作用增强[8]。


  5.5PEG化HLA抗原


  人类白细胞抗原(Humanleucocyteantigen,HLA)是保持个体稳定的一组糖蛋白,在移植免疫中起着重要作用。李伟,张印则等为了研究mPEG有效修饰HLA抗原,阻断HLA抗原与其相应抗体间特异性免疫反应的方法.在22℃.pH7.4的PBS介质中,采用浓度梯度法修饰淋巴细胞表面HLA抗原。结果显示经mPEG处理后的淋巴细胞表面HLA-1类抗原与其相应抗体间的微量淋巴细胞毒试验为阴性。也就是经mPEG修饰后可以完全阻断HLA—I类抗原与其相应抗体间的特异性免疫反应[9]。


  6展望


  近年来生物技术领域发展迅速,许多肽类和蛋白质类药物用于治疗包括癌症在内的多种疾病,取得了较好的疗效。但这些生物制品从血浆中的快速清除和可能的免疫原性限制了其应用[10]。


  PEG技术作为药物输送领域的一项里程碑技术可以较满意地解决以上问题,其几乎可应用于所有的药物,尤其是半衰期短、用药频繁、用药周期长、毒性大的药物。从PEG修饰药物的药理特性、工艺技术、临床应用前景等来看,国内外企业应尽快掌握该项技术,其具有重要应用价值。


  参考文献


  [1]WalshG.Biopharmaceuticalbenchmarks[J].NatBiotechnol,2000,18:831-833.


  [2]李力,郑意端.蛋白药物聚乙二醇化技术的研究进展[J].中国临床药理学杂志.2003,l9(3):226-229


  [3]黄河.PEG修饰蛋白质等高分子[J].化学推进剂与高分子材料.2004,2(5):18-22


  [4]AbuchowskiA,VanEsT.PalczukNC,eta1.Alterationofimmunologicalpropertiesofbovineserumalbuminbycovalentattachmentofpolyethyleneglycol[J].JBiolChem,1977,252:3578-3581.


  [5]HadleyKB,SatoPH.Enzyme,l989,42:225-234


  [6]JohnsonAJ,KarpatkinMH,NewmanJB.JHematol,1971,21:21


  [7]吴洁,刘景晶,胡卓逸.蛋白质药物的聚乙二醇修饰[J].药学进展,2002,26(3):l46-152


  [8]朱珺,王松梅等.抗肿瘤转移多聚β肽聚乙二醇化的研究[J].中国新药与临床杂志(ChinJNewDrugsClinRem),2005,24(9):723-726


  [9]李伟,张印则等.mPEG修饰HLA抗原的方法学研究[J].生命科学研究.2003,7(4):374-376


  [10]邹寿涛.聚乙二醇化蛋白质和肽类复合物研究进展[J].中南药学.20012(6):357-360


扫描二维码,关注华腾制药

您可以获得:

1.更高效的沟通体验

2.更快速的报价通知

3.更专业的服务质量

华腾制药二维码

微信公众号